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KLH蛋白和多肽通過SMCC偶連實驗記錄-BS3/SPDP/DSS

SMCC是一類含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯和馬來酰亞胺的雙功能偶聯劑.可以將分別含有巰基和氨基的化合物鍵接在一起。該交聯試劑可滲透到細胞膜的脂質雙層中，NHS活性酯與伯胺在PH7-9的環境形成酰胺鍵。馬來酰胺與巰基在PH6.5-7.5的環境下形成穩定的硫醚鍵。在水溶液中，NHS活性酯的水解是（與氨基的反應）個競爭反應。馬來酰胺比NHS穩定，但是在PH大于7.5時，馬來酰胺會慢慢水解，失去與巰基反應的特異性。因而，在使用SMCC時通常是在PH7.2-7.5的環境下進行，并且先讓NHS發生反應。

SMCC結構里的環己烷環可以降低馬來酰胺的水解速率。這使得蛋白質在用SMCC修飾之后可以凍干存放一段時間。很多蛋白質都選用該試劑來進行馬來酰亞胺修飾。

KLH (Keyhole LimpetHemocyanin)，即血藍蛋白，是在某些軟體動物、節肢動物(蜘蛛和甲殼蟲)的血淋巴中發現的一種游離的藍色呼吸色素。血藍蛋白含兩個直接連接多肽鏈的銅離子，與含鐵的血紅蛋白類似，它易于氧結合，也易與氧解離，是已知的惟一可與氧可逆結合的銅蛋白，氧化時呈青綠色，還原時呈白色。其分子量45０ ０00～１30 000。由于KLH比BSA有更高的免疫原性，因而是最常被選用的載體蛋白。

用SMCC來制備抗體-酶或者半抗原作載體的蛋白質，經常采用兩步合成法。首先，含有氨基的蛋白質與幾倍的偶聯劑反應，反應結束后通過脫鹽柱或者透析的方法除掉沒有反應完的SMCC。然后，再與含有巰基的蛋白質反應。在實際操作中要注意的是，SMCC怕潮濕，存放時要和干燥劑一起存放。并且使用中從冰箱拿出來時要先在室外放置一段時間平衡溫度，以免立刻開啟，空氣中水分遇冷凝結，破壞SMCC 結構。

1、  將 20 mgSMCC（這是聯接40條多肽的量）溶于2 ml DMF。

2、  將0.8 mlKLH加入到25 ml圓底燒瓶中，補加1×PBS(pH 7.2)使蛋白終濃度為15 mg/ml。

3、  將溶解好的SMCC溶液緩慢滴加到120mg KLH 蛋白體系中，室溫攪拌反應1h。

4、  用1 L1×PBS (PH 7.4) 溶液于4℃下透析 6 小時，除去游離的SMCC。

5、  將透析后的KLH蛋白倒入50ml離心管中，通過離心管的刻度確定其體積，根據反應前加入的KLH蛋白的量來計算透析后蛋白的濃度，然后根據其濃度將2.5 mg KLH-SMCC溶液轉移到5 ml離心管中。
例如：反應前加入KLH蛋白的量為120 mg，透析后的KLH蛋白體積為20ml，那么透析后的KLH蛋白濃                                                     μlKLH-SMCC溶液轉移到5 ml離心管中。

6、  將 3.0 mg多肽用 0.6 ml 1×PBS (pH 7.2) 溶液溶解。
注意：這里多稱量出0.5 mg多肽是用來做ELISA檢測的，取出100μl即可。檢測多肽隨交聯好的抗原一起寄出，濃度為5 mg/ml。

7、  用Ellman試劑檢測多肽中的巰基：在96孔板中加入100μl Ellman試劑儲備液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度計在λ=412nm下測其紫外吸收值，如果OD值>0.15做      下一步；OD值<0.15并>0.05補加多肽，直至達到要求；OD值<0.05返回多肽合成步驟重新質控。
Ellman試劑是用來檢測游離巰基的，如果檢測液顯黃色說明多肽的Cys的巰基大部分以游離態存在；如果檢測液不顯黃色則說明多肽Cys中的巰基已經被氧化形成二聚體或多聚體。

8、  將多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室溫下用垂直混勻器混勻反應4小時。

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產品列表：

Sulfo-NHS，N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽，CAS#: 106627-54-7

Biotin-ONP，(+)-生物素-4-硝基苯酯，CAS#: 33755-53-2

Biotin-PFP，五氟苯酚生物素酯/生物素五氟苯酯，CAS#:120550-35-8

6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯，CAS#:55750-63-5

6-Maleimidohexanoic acid，CAS#：55750-53-3

N-Maleoyl-β-alanine（MPA），CAS#：7423-55-4

4-Maleimidobutyric acid（MBA），CAS#：57078-98-5

11-馬來酰亞胺十一烷酸 N-琥珀酰亞胺酯，CAS#：87981-04-2

2-馬來酰亞胺基乙酸，CAS#：25021-08-3

11-Maleimidoundecanoic acid（KMUA）CAS#：57079-01-3

Sulfo-EMCS, ε-馬來酰亞胺己酸磺基琥珀酰亞胺酯  CAS#：215312-86-0

AMAS, CAS#：55750-61-3

1,2-Bis(maleimido)ethane, CAS#：5132-30-9

Boc-6-Ahx-OSu, CAS#：51513-80-5

N-Boc-2,2-(ethylenedioxy)diethylamine ,CAS#：153086-78-3

N,N,N,N-Tetramethyl-p-phenylenediamine,CAS#：100-22-1

N-Succinimidyl 6-Biotinamidohexanoate, CAS#：72040-63-2

N-(+)-Biotinyl-6-aminohexanoic acid  CAS#：72040-64-3

CAS#：127062-22-0

DTSSP

BS3  CAS#: 82436-77-9

BS2G

BSG             CAS#: 79642-50-5

DSP        CAS#: 57757-57-0

DSS        CAS#: 68528-80-3

DTSSP    CAS#: 81069-02-5

EGS       CAS#: 70539-42-3

Sulfo-EGS    

DSSeb    CAS# 23024-29-5

BMPS     CAS#: 55750-62-4

EMCS     CAS#: 55750-63-5

GMBS    CAS#: 80307-12-6

LC-SPDP      

MBS       CAS#: 58626-38-3

PDPH           

SBA       CAS#: 42014-51-7

SIA        CAS#: 39028-27-8

SMCC     CAS#: 64987-85-5

SMPB     CAS#: 79886-55-8

SMPH    

SPDP      CAS#: 68181-17-9

Sulfo-LC-SPDP    

Sulfo-MBS

Sulfo-SANPAH            CAS #: 102568-43-4

Sulfo-SMCC                 CAS#: 92921-24-9

Biotin Hydrazide           CAS #: 66640-86-6

NHS-Biotin                  CAS#: 35013-72-0

NHS-SS-Biotin             CAS #: 142439-92-7

Sulfo-NHS-Biotin

HPG                            CAS#: 24645-80-5

SATA                           CAS#: 76931-93-6

Sulfo-NHS Acetate        CAS #: 152305-87-8

Biotin-maleimide         

Biotin ethylenediamine hydrobromide  CAS# 216299-38-6

Biotinamidohexanoic acid hydrazide     CAS#: 109276-34-8

CAS#: 89889-52-1

TSAT

BMPH           CAS#:359436-61-6

EMCH           CAS#:151038-94-7

KMUH           CAS#:1593661-78-9

BMOE           CAS:5132-30-9

BMB              CAS#:28537-70-4

BMH (bismaleimidohexane)         CAS#:4856-87-5

TMEA

DTME           CAS#:71865-37-7

SATP             CAS#:84271-78-3

EMCA           CAS:55750-53-3

AEDP           

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