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內(nèi)容提要

CO不僅可以選擇性地殺傷**細(xì)胞，而且由于缺乏主動的**靶向能力，抗**效果有限。將線粒體靶向的線粒體內(nèi)微環(huán)境響應(yīng)前藥(FeCO-TPP)封裝在介孔二氧化硅納米顆粒內(nèi)，再通過靜電分步組裝，將其包覆在透明質(zhì)酸上，構(gòu)建一種新型智能納米藥物，并以分步分解的方式實(shí)現(xiàn)**組織細(xì)胞/線粒體靶向的CO多階段控制釋放。CO的多階段靶向控釋釋放包括(i)被動靶向**組織的納米藥物釋放，(ii)主動靶向**細(xì)胞的納米藥物釋放，(iii)酸響應(yīng)性前藥釋放，(iv)線粒體靶向性前藥釋放以及(v)ROS響應(yīng)性CO釋放。該納米藥物有效地增強(qiáng)了CO在體內(nèi)外治療癌癥的有效性和安全性。本文提出的多階段組裝/解組裝策略為CO的靶向治療打開了一個新的窗口。

前言

高血藥濃度和低瘤內(nèi)積累分別會導(dǎo)致CO中毒風(fēng)險(xiǎn)和限制CO治療療效。目前CO治療的兩種主要給藥途徑是直接吸入CO氣體和吸收CO前藥。直接吸入CO氣體很難控制CO的攝入量，而現(xiàn)有CO前藥缺乏**靶向能力。兩種CO給藥途徑都有較高的CO中毒風(fēng)險(xiǎn)。因此，CO的靶向釋放和控釋對于提高CO治療的有效性和生物安全性至關(guān)重要。基于多功能納米材料的智能納米藥物靶向遞送CO前藥和瘤內(nèi)控釋CO是一種重要策略。但是，已被開發(fā)的**靶向遞送和控制釋放CO的納米藥物只能將CO遞送到溶酶體或細(xì)胞質(zhì)中，而不是線粒體。線粒體是CO發(fā)揮其生理功能的靶點(diǎn)，其中CO通過與氧氣激烈競爭結(jié)合細(xì)胞色素c氧化酶以損害**細(xì)胞線粒體生物能，從而抑制線粒體呼吸，導(dǎo)致**細(xì)胞凋亡。CO前藥順序靶向遞送到**組織、細(xì)胞、線粒體可能會獲得理想的CO治療效果。作者提出了一種多階段靶向釋放和控釋策略，構(gòu)建了一種多功能智能納米藥物(FeCO-TPP@MSN@HA)，有序?qū)崿F(xiàn)納米藥物靶向**組織(第一步靶向)、靶向**細(xì)胞(第二步靶向)、一種新的CO前體藥物的納米藥物酸響應(yīng)釋放(第一步控釋)，前體藥物的線粒體靶向釋放(第三步靶向)，以及CO的線粒體內(nèi)活性氧(ROS)響應(yīng)釋放(第二步控釋)。本工作選擇帶負(fù)電荷的介孔二氧化硅納米顆粒(MSN)作為生物相容性載體，通過靜電組裝有效地負(fù)載帶正電荷的線粒體靶向/線粒體微環(huán)境響應(yīng)藥物前體FeCO-TPP前藥，實(shí)現(xiàn)FeCO-TPP前藥的酸響應(yīng)降解和釋放，通過靜電組裝將透明質(zhì)酸(HA)進(jìn)一步包覆在小型單分散二氧化硅(FeCO-TPP@MSN@ HA)表面，既可以通過增強(qiáng)通透性和保留(EPR)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動靶向**，也可以主動靶向過表達(dá)CD44的**細(xì)胞，通過分段靶向釋放和控釋，以逐步解組裝的方式實(shí)現(xiàn)高效和安全的線粒體靶向CO治療癌癥的體內(nèi)外，能夠?qū)?/span>CO遞送到癌細(xì)胞的線粒體，顯示出癌癥治療的最大結(jié)果。

結(jié)果與討論

FeCO-TPP前藥和FeCO-TPP@MSN@HA的關(guān)鍵是既能以靶向的方式積累到線粒體中，又能以響應(yīng)的方式在線粒體中釋放CO。帶正電荷的TPP陽離子由于其靜電和親脂性吸引線粒體膜，是一種很好的線粒體靶向分子。此外，金屬羰基化合物能夠通過類Fenton反應(yīng)，ROS響應(yīng)分解為CO。作者將TPP衍生物[3-羧基丙基三苯基溴化膦(TPP-COOH)]與金屬羰基化合物(FeCO)偶聯(lián)，合成了前藥FeCO-TPP。為了保護(hù)FeCO-TPP前藥并將其運(yùn)送到**細(xì)胞中進(jìn)行后續(xù)線粒體靶向，作者利用帶負(fù)電荷的MSN包覆帶正電荷的FeCO-TPP，利用EPR效應(yīng)進(jìn)行**靶向傳遞，然后靜電組裝包覆一層HA (CD44的受體)來識別過表達(dá)CD44蛋白的**細(xì)胞。所合成的單分散二氧化硅具有均勻的粒徑(約70 nm)、良好的分散性和高負(fù)的表面電位，有利于前藥負(fù)載和HA包覆。從圖1的D和E中可以發(fā)現(xiàn)，在單分散二氧化硅表面覆蓋了一層較薄的低對比度HA (約15 nm)。SEM圖像(圖1F)和DLS數(shù)據(jù)(圖1I)顯示，合成的FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物保持了良好的分散性，由于HA涂層，其水化直徑略有增加(圖1F和1I)。FeCO-TPP@MSN的高正電勢使其易于靜電組裝，導(dǎo)致HA涂層使合成的FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物的表面電位接近中性，并防止FeCO- TPP前藥和HA涂層在水溶液中高穩(wěn)定性的泄漏)。

圖1. (C) 單分散二氧化硅的透射電鏡(TEM)圖像。FeCO-TPP@MSN@HA的TEM (D)，高角度環(huán)形暗場(HADDF) (E)，掃描電子顯微鏡(SEM) (F)和元素映射(G)。MSN，FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN@HA的Zeta勢(H)，動態(tài)光散射(DLS)粒徑分布(I)和FTIR光譜(J)。

FeCO-TPP@MSN@HA能夠在到達(dá)**部位后識別/粘附到**細(xì)胞上，然后在被溶酶體吞入過程中脫去HA。為了證實(shí)這一順序過程，包括靶向**組織的納米藥物遞送，靶向**細(xì)胞的納米藥物遞送，對酸敏感的前藥釋放，靶向線粒體的前藥遞送，首先在體外模擬條件下研究FeCO-TPP@MSN的酸/ ROS響應(yīng)釋放行為。FeCO-TPP@MSN在pH 7.4的PBS溶液中相當(dāng)穩(wěn)定，但在pH 6.8的微酸溶液中，FeCO-TPP前藥的釋放急劇，較高的酸度導(dǎo)致前藥釋放更快。這種酸響應(yīng)行為來自于與帶正電荷的FeCO-TPP前藥物的質(zhì)子交換(圖2A)。MSN表面的許多硅醇基團(tuán)(Si─OH)可以電離成硅酸鹽(Si─O?)吸附FeCO-TPP⁺，也可以在酸性條件下質(zhì)子化脫附/釋放FeCO-TPP+。作者進(jìn)一步研究了不同濃度·OH下釋放的FeCO-TPP前藥對ROS的響應(yīng)性CO釋放行為以模擬線粒體富集ROS的微環(huán)境。在·OH存在的情況下，FeCO-TPP由于·OH的強(qiáng)烈氧化而分解為CO（圖2B）。根據(jù)**的Warburg效應(yīng)，·OH濃度越高，CO釋放越快，對惡性**細(xì)胞的影響越強(qiáng)烈。

圖2. FeCO-TPP@MSN納米藥物在體外模擬條件下的酸響應(yīng)性前藥釋放曲線(A)和FeCO-TPP前藥在不同·OH濃度下的線粒體內(nèi)ROS響應(yīng)性CO釋放曲線(B)。

利用激光共聚焦對體外連續(xù)多階段靶向釋放和細(xì)胞控釋過程進(jìn)行了評價(jià)。首先，分別用紅羅丹明B異硫氰酸酯(RITC)和8-巰基喹啉(QL)標(biāo)記MSN載體和FeCO-TPP前藥構(gòu)建FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物進(jìn)行熒光示蹤。HeLa和4T1細(xì)胞在相同條件下與其他癌細(xì)胞相比，可以更有效地吞入FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物，因?yàn)樗鼈兊?/span>CD44顯著過表達(dá)(圖3A)。同時(shí)，納米藥物很少被正常的MCF-10A和人類胚胎腎(HEK) 293T內(nèi)吞，因?yàn)?/span>CD44正常低表達(dá)的細(xì)胞，因此該納米藥物可以專一靶向CD44過表達(dá)的癌細(xì)胞，并進(jìn)行靶向給藥。作者選擇具有最高識別性的HeLa細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步靶向釋放和控釋階段的研究。HeLa細(xì)胞內(nèi)吞FeCO-TPP@MSN@HA后，主要位于溶酶體(圖3B)，主要體現(xiàn)在綠色和紅色合并成黃色。藍(lán)色逐漸出現(xiàn)，表明FeCO-TPP前藥從納米藥物在溶酶體的酸性環(huán)境中的持續(xù)釋放。為了追蹤前藥在線粒體內(nèi)的靶向性，我們在與納米藥物共孵卵后，用綠色MitoTracker染料對HeLa細(xì)胞線粒體進(jìn)行染色。將MSN載體和FeCO-TPP前藥分別用紅色RITC和藍(lán)色QL標(biāo)記，構(gòu)建FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物進(jìn)行熒光示蹤。為了便于區(qū)分藥物釋放監(jiān)測的顏色，我們將共焦圖像中的線粒體和MSN通道分別設(shè)置為紅色和綠色。紅色和藍(lán)色的出現(xiàn)產(chǎn)生了紫色，代表前藥在線粒體內(nèi)的積累。紫色的增加代表線粒體，對釋放的FeCO-TPP前藥的攝取（圖3C）。隨著前藥在溶酶體中從納米藥物釋放，前藥通過TPP分子識別逐漸積累到線粒體中，表現(xiàn)為線粒體靶向前藥傳遞階段。FeCO-TPP前藥的線粒體靶向能力歸功于其與線粒體膜的靜電和親脂性吸引，為線粒體響應(yīng)性CO釋放提供了機(jī)會。熒光COP-1 (CO probe -1)探針用于檢測細(xì)胞內(nèi)CO釋放。隨著孵育時(shí)間的增加，綠色熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)反映了CO在HeLa細(xì)胞中釋放的增加（圖3D）當(dāng)FeCO-TPP前藥到達(dá)HeLa細(xì)胞線粒體時(shí)，線粒體內(nèi)ROS觸發(fā)了CO的釋放，這是由于其ROS響應(yīng)行為。以上四個方面的研究結(jié)果證實(shí)了多階段順序靶向釋放和控釋過程。

圖3所示。 (A) HeLa、4T1、B16和MCF-10A細(xì)胞與FeCO-TPP@MSN-RITC@HA孵育4小時(shí)，并用4,6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色，MSN載體用紅色的RITC標(biāo)記，然后用于構(gòu)建FeCO-TPP@MSNRITC@HA納米藥物。(B) FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物的溶酶體內(nèi)酸響應(yīng)前藥釋放行為，LysoTracker染色(綠色)，FeCO-TPP前藥用藍(lán)色QL(8-巰基喹啉)標(biāo)記。(C) FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物的線粒體靶向前藥物傳遞行為，MitoTracker(紅色)染色。

選擇兩個**細(xì)胞系(HeLa和4T1)和兩個正常細(xì)胞系(HEK-293T和MCF-10A)研究FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物的體外抗癌性能。從圖4 (A到D)， FeCO-TPP，FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN@HA對兩種癌細(xì)胞均表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒性行為，但在0-100 mg/ml濃度范圍內(nèi)，盡管孵育時(shí)間較長，對正常細(xì)胞的毒性不顯著。與FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN相比，FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物在相同的孵育濃度和時(shí)間下對癌細(xì)胞的損傷最大，這可能與靶向給藥有關(guān)。從圖4 (A和B)， FeCO-TPP@MSN@HA對HeLa和4T1細(xì)胞的ED₅₀分別為82.6和41.5 mg/ml)。作者還使用CORM-3作為CO供體來測量ED₅₀值在HeLa和4T1細(xì)胞上CO的濃度分別為147.3和110.9 mM。盡管CO持續(xù)釋放，FeCO- TPP@MSN@HA仍容易快速達(dá)到足夠高的CO濃度殺滅**細(xì)胞。FeCO- TPP@MSN@HA的細(xì)胞毒性隨著孵育時(shí)間的延長而顯著增加(圖4,A和B)，甚至高于游離前藥FeCO- TPP。這可能是由于HA介導(dǎo)的靶向抑制正常細(xì)胞對FeCO- TPP@MSN@HA納米藥物的攝取和/或CO的保護(hù)作用。作者還從細(xì)胞能量代謝的角度研究了納米藥物的癌癥選擇性機(jī)制。從圖4 (E H), MSN幾乎沒有影響腺苷5 '三磷酸腺苷(ATP)含量的HeLa和MCF-10A細(xì)胞,而FeCO-TPP FeCO-TPP@MSN,和FeCO-TPP@MSN@HA顯著抑制ATP的HeLa細(xì)胞水平按照線粒體數(shù)量減少(圖4,I和J),導(dǎo)致抗癌的結(jié)果。此外，細(xì)胞內(nèi)乳酸水平FeCO-TPP@MSN@HA治療后明顯增強(qiáng)，表明在糖酵解過程中有氧呼吸的HeLa細(xì)胞被CO抑制，而無氧呼吸和乳酸消耗被激活,導(dǎo)致HeLa細(xì)胞ATP水平下降。雖然FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN也抑制了MCF-10A細(xì)胞的ATP水平(圖4E)，但線粒體數(shù)量并沒有減少(圖4,K和L)，這可能是因?yàn)閺钠湫孤┑膸д姾傻?span times="" new="" roman="">FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN和/或CO容易被內(nèi)吞噬，從而在一定程度上影響線粒體功能，而中性的FeCO-TPP@MSN@HA不泄漏CO則不會。FeCO-TPP@MSN@HA對MCF-10A細(xì)胞的ATP水平和線粒體數(shù)量均無影響(圖4,E, K和L)，因?yàn)樗哂凶R別CD44的能力，反映了對正常細(xì)胞的低細(xì)胞毒性。基礎(chǔ)呼吸情況與ATP產(chǎn)生情況相似(圖4F)，但經(jīng)FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN @HA處理的MCF-10A細(xì)胞的最大呼吸和質(zhì)子泄漏仍保持不變(圖4G)，進(jìn)一步說明了保護(hù)作用。綜上，FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物損害了癌細(xì)胞線粒體功能，但保護(hù)了正常細(xì)胞的線粒體，維持正常的能量代謝。

圖4. (A到D) FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物對癌癥(HeLa和4T1細(xì)胞)和正常(MCF-10A和HEK-293T細(xì)胞)模型細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。(E to H)通過ATP產(chǎn)生(E)、基礎(chǔ)呼吸(F)、最大呼吸(G)和質(zhì)子泄漏(H)評價(jià)細(xì)胞能量代謝。(I和K)處理后的HeLa和MCF-10A細(xì)胞共聚焦圖像，細(xì)胞核和線粒體分別染成藍(lán)色和紅色。(J)和(L)分別為(I)和(K)中紅色熒光強(qiáng)度的定量。平均值和誤差用平均值±SD表示。P值采用雙尾Student 's t檢驗(yàn)計(jì)算(**P < 0.01， ***P < 0.001;NS，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。比例尺(I和K)， 20 mm。OCR，耗氧量

在靜脈注射FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物用于**治療之前，首先靜脈注射FeCO-TPP@MSN@HA后檢查其血液安全性與PBS對照、MSN載體、FeCO-TPP前藥和FeCO-TPP@MSN進(jìn)行比較，其中包含等量的MSN和FeCO-TPP。采集不同時(shí)間點(diǎn)(注射后1、7、20天)的血樣進(jìn)行測定。與PBS對照相比，相同劑量的MSN載體、FeCO-TPP前藥和FeCO-TPP@MSN, FeCO-TPP@MSN@HA在注射后20天內(nèi)(治療時(shí)間相同)未對肝臟和腎功能造成重大損害。此外，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞體積分布寬度等標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)指標(biāo)水平無明顯差異，表明FeCO-TPP@MSN@HA具有較高的血液相容性。使用FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物進(jìn)行體內(nèi)治療，分別使用攜帶B16和4T1**的小鼠模型。首先，研究了**靶向傳遞行為。從Fig. 5A的體內(nèi)熒光成像結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，游離的FeCO-TPP快速排出，瘤內(nèi)積累很少，而MSN和FeCO- TPP@MSN@HA均能有效積累到**中。從CD31染色(綠色血管)的**切片顯示，FeCO- TPP@MSN@HA納米藥物溢出(圖5B)，并與封裝的FeCO- tpp前藥一起滲透到**細(xì)胞中(圖5C)，表明所研究的**的EPR效應(yīng)和納米藥物對**的有效靶向傳遞。B16荷瘤**小鼠隨機(jī)分為5組(n = 5)靜脈注射PBS控制, MSN載體), FeCO-TPP前體藥物, FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN@HA，分別等摩爾濃度的MSN或FeCO-TPP。從圖5 (D - F)的治療結(jié)果來看，MSN載體對B16荷瘤小鼠的**生長沒有影響。相比之下，FeCO-TPP在治療20天后雖無**靶向能力，但對**生長有輕微抑制作用，而FeCO-TPP@MSN由于其被動作用，在一定程度上增強(qiáng)了**治療效果目標(biāo)的行為。此外，FeCO-TPP@MSN@HA可以進(jìn)一步提高**治療療效由于其被動和主動目標(biāo)概要文件(圖5 D, F)。的H&E染色**切片進(jìn)一步證實(shí)FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物可以消除**細(xì)胞最有效而FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN(圖5 g)。各治療組對心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均未造成明顯損傷，說明治療劑量時(shí)生物相容性良好。用FeCO-TPP@MSN@HA納米藥物治療的小鼠沒有明顯的體重減輕，這表明健康狀況良好。

圖5. **靶向的熒光圖像：FeCO-TPP**小鼠靜脈注射的藥物前體，MSN的載體，FeCO-TPP@MSN@HA(A)。FeCO-TPP@MSN@HA治療的**切片CD31染色(B和C),綠色,紅色,和藍(lán)色代表血管，MSN，和FeCO-TPP。納米藥物治療B16**的結(jié)果:**體積隨時(shí)間變化(D)，治療20天后**重量比較(E)，小鼠體重隨時(shí)間變化(F)， H&E染色對治療后**的組織學(xué)分析(G)。平均值和誤差用平均值±SD表示。通過Tukey事后檢驗(yàn)的單因素方差分析(ANOVA)計(jì)算P值，以校正多重比較(*P < 0.05， **P < 0.005， ***P < 0.0005)。比例尺200mm